本应用对饲料原料样品（花生粕、豆粕、棉粕）中黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2（AFB2）、G2（AFG2）,G2（AFG2）的检测方法进行了验证，通过对比不同前处理方法对黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2检测结果的影响，确定了较佳的提取条件，采用自动化前处理仪器ASPE480免疫亲和固相萃取系统，建立了免疫亲和柱全自动净化-液相色谱串联质谱法测定饲料原料中黄曲霉毒素的测定方法。

结果表明：4种黄曲霉毒素在不同样本中的回收率在82.2%～109.8%之间，精密度RSD小于8.9%。本方法可批量自动化处理样品，提高工作效率，避免因人员操作导致的结果偏差，可用于大量粮食饲料中真菌毒素的精准测定。

仪器及试剂

●  仪器设备：

AB SCIEX QTRAP 6500+四级杆-线性离子阱串联质谱仪；

Waters Acquity超高效液相色谱，配备柱后衍生系统及荧光检测器；

ASPE480全自动免疫亲和固相萃取系统；

氮吹仪；

离心机。

● 试剂和耗材：

色谱纯：甲醇、乙腈、甲酸。其他试剂如：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾均为分析纯；

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准溶液；

多功能净化柱；

黄曲霉毒素免疫亲和柱；

黄曲霉毒素磁性分子印迹微球。

 实验条件

● 液相条件设置

色谱柱：Waters BEH C18柱（100 mm× 3.0 mm，1.7 μm）；柱温：35℃；进样量 5 μL；流动相流速：0.3 mL/min，梯度淋洗。

流动相梯度条件

● 质谱条件设置

质谱采用电子喷雾离子源，正离子扫描模式。喷雾电压为5.5 Kv；毛细管温度为500℃；脱溶剂气为空气、碰撞气为高纯氮气，气量为 50，50arb。具体的参数见下表。

质谱扫描参数

● 固相萃取系统方法设置

按照如下方案，在ASPE480免疫亲和固相萃取系统上设置方法。如下图。

仪器方法-黄曲霉毒素B1

实验方案

● 实验样本：

本实验采用3种自然污染的黄曲霉毒素阳性样本，为花生粕、豆粕、棉粕样本。

● 方法考察：

不同提取溶剂对检测结果的影响

选取9个自然污染的花生粕样本、2个豆粕样本、1个棉粕样本和1个配合饲料样本，分别使用84%的乙腈水溶液和80%的甲醇水溶液对上述样品进行振荡提取。提取溶液按照1:4的比例加入PBS溶液稀释。稀释液全部过免疫亲和柱后，加水淋洗，甲醇洗脱。洗脱液氮吹近干，加1 mL50%甲醇溶液复溶，过0.22μm滤膜，上机检测。

不同提取溶剂对饼粕样品提取结果

对于花生粕、棉粕等饲料样品中的黄曲霉毒素，84%的乙腈水溶液作为提取溶剂的检测结果要显著高于80%的甲醇水溶液的检测结果，这表明对于饼粕类饲料样品，84%乙腈溶液的提取效率要显著高于80%甲醇。而对于配合饲料样品，两种溶剂的提取效果并不显著。

不同净化方法对检测结果的影响

选取9个自然污染花生粕样本、2个豆粕样本和1个棉粕样品，考察不同净化方法对检测结果的影响。实验选择85%的乙腈作为提取溶剂，以黄曲霉毒素免疫亲和柱、真菌毒素多功能净化柱、磁性分子印迹微球等三种净化材料对提取溶液进行净化处理，测定结果见下表：

不同提取溶剂对饼粕样品提取结果

免疫亲和柱净化法的LC-MS/MS谱图

磁性分子印迹净化法的LC-MS/MS谱图

 多功能净化柱法的LC-MS/MS谱图

使用三种不同的净化方法处理样品，其检测结果基本一致，并无显著差别。然而通过质谱图对比可知，使用免疫亲和柱净化法，所得谱图干扰最少，净化效果最佳。

方法验证

以花生粕、豆粕及棉籽粕样品为基础进行空白添加实验，验证该方法的准确度和精密度。每种饲料原料样品中添加3个浓度水平的黄曲霉素素，每个浓度设6个平行，计算回收率和变异系数，结果见表8。结果表明：在3个浓度添加水平下，平均回收率82.2%～109.8%之间，RSD值在1.9%-8.9%，方法的准确度和精密度均满足要求。

不同饲料原料中添加4种黄曲霉毒素的回收率及精密度（n=6）

实验结论

采用美正ASPE480免疫亲和固相萃取系统，建立了免疫亲和柱全自动净化-液相色谱串联质谱法测定花生粕、豆粕和棉粕中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法。

结果标明：黄曲霉毒素B1在不同样本中的回收率82.2%～109.8%之间，RSD小于8.9%，回收率和重现性良好。本方法可批量自动化处理样品，节省操作时间，提高工作效率，避免因人员操作导致的结果偏差，可用于大量粮食饲料中真菌毒素的精准测定。